如果把生物藥研發(fā)-生產(chǎn)-上市這條道路比作一場艱苦卓絕的修行，細胞株構(gòu)建則是征途之始。基于“質(zhì)量源于設計”的理念，我們希望在起點就篩選到一個“天資卓絕，根骨極佳”的細胞株，方方面面都符合預期標準，避免耗時費力的優(yōu)化工作，使得后續(xù)的上下游工藝開發(fā)（沒錯，對下游工藝也很重要）、工藝放大、質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)一片通途。

在評價細胞株的各項指標中，表達量高低無疑是通常最受關(guān)注的一項。我們的細胞株平臺一年要完成15~20個左右穩(wěn)定細胞株項目（附表. 2020年部分穩(wěn)定細胞株項目類型和表達量），項目大多為單抗和雙特異性抗體，兼有少量融合蛋白。

就以上分子結(jié)構(gòu)而言，使用CHO-K1細胞株構(gòu)建平臺，經(jīng)過10-12周的細胞株構(gòu)建和篩選過程，14天的CD 培養(yǎng)基Fed-batch培養(yǎng)工藝下，細胞群表達量2~6g/L，克隆表達量4~8g/L是符合預期的表達量范圍。當然，極少數(shù)的特殊情況下最終的單克隆細胞株表達量低于預期，我們傾向于認為該分子相對“Difficult to Express”。從Drug Discovery階段成百上千個候選分子中，經(jīng)歷一系列篩選及成藥性評估后脫穎而出的一個或幾個佼佼者，進入到穩(wěn)定細胞株構(gòu)建階段后，為什么有的表達量高，有些表達量卻還是低于我們的預期呢？?

眾所周知，外源蛋白在宿主細胞中的表達過程即為外源基因?qū)?轉(zhuǎn)錄-翻譯-蛋白質(zhì)折疊加工分泌的過程。然而宿主細胞是活的生命體，微米級別的小小生命體內(nèi)運行著一套精巧復雜的自有法則，在大部分常規(guī)的穩(wěn)定細胞株構(gòu)建過程中，我們往往只能利用脂質(zhì)體、電穿孔等方法進行第一步的播種，目的基因進入細胞內(nèi)部后生根發(fā)芽開花結(jié)果等一系列微觀過程則難以掌控。因此，在從基因到蛋白的任意一個步驟出問題，都有可能影響最終的細胞株表達量。

有研究建立了一個診斷模型來探究造成細胞株表達量低的因素，具有一定的參考價值。對于一個表達量低于預期的Mab A，可選取一個表達量正常的Mab B進行對照，利用定點整合的方法構(gòu)建細胞株以最大程度地排除隨機整合帶來的基因水平異質(zhì)性。接著進行如下研究：

01

探究表達產(chǎn)物對細胞是否有影響

利用四環(huán)素調(diào)控表達系統(tǒng)（Tet-on），在細胞群篩選過程中分為”Induced”(+Dox)和“Not Induced”（-Dox）兩組，再分別進行單克隆篩選。篩選出的單克隆進行Fed-batch，比較不同條件下單克隆之間表達量、生長、Qp等方面的區(qū)別。在Dox持續(xù)存在下，表達被激活，表達產(chǎn)物持續(xù)積累。如若克隆在Dox是否持續(xù)存在下，表現(xiàn)有顯著差別，則可初步判斷因表達產(chǎn)物的毒性導致細胞株表達量低。

02

探究基因轉(zhuǎn)錄水平是否正常

利用qRT-PCR檢測細胞株輕重鏈mRNA相對表達水平，與正常表達細胞株進行比較，如若結(jié)果有顯著性差別，則可初步判斷因轉(zhuǎn)錄水平不足導致細胞株表達量低。

03

探究目的蛋白的分泌情況

利用環(huán)乙酰亞胺（cycloheximide，CHX）抑制蛋白質(zhì)翻譯，結(jié)合Dox的作用觀察目的蛋白的分泌、折疊和降解情況。在CHX和Dox共同存在的情況下，目的基因表達被激活而蛋白質(zhì)合成受到抑制，利用Western Blot檢測培養(yǎng)上清中有無目的蛋白輕重鏈條帶。解除CHX抑制后在固定時間間隔同步檢測上清中Mab A&B的輕重鏈表達情況，如二者有顯著性差別，則表明正確折疊和組裝蛋白不能正常分泌到胞外，從而影響細胞株表達量。

04

探究目的蛋白的折疊裝配情況

將經(jīng)CHX處理后的細胞收集裂解，提取胞內(nèi)總蛋白，觀察細胞內(nèi)部輕重鏈積累情況，同時關(guān)注BiP的積累。BiP是可與不正確折疊或錯誤組裝蛋白結(jié)合，使其停留在未折疊狀態(tài)的一類分子伴侶，其積累水平可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)的指征。如觀察到胞內(nèi)輕鏈或重鏈有相對異常積累，且BiP水平相對較高的現(xiàn)象，則可判斷目的蛋白在胞內(nèi)積累導致細胞株表達量低于預期。

在了解造成細胞株低表達的因素后，我們通過“先天”的手段，如序列優(yōu)化、表達載體及宿主細胞改造等，可以一定程度上提高細胞株表達量；“后天”也能通過對細胞株“私人訂制”的培養(yǎng)工藝在提高表達量方面取得一些成果。然而，在我們孜孜不倦地追求越來越高的細胞株表達量時，不禁引人思考：細胞株的表達量是越高越好嗎？

答案無疑是否定的。表達量是評價細胞株重要卻不唯一的維度，從整個項目周期來看，F(xiàn)inal Clone的確起到了一錘定音的效果，后續(xù)的工作都必須圍繞著它進行，也因此，在敲定最后的細胞株之前應當為未來環(huán)節(jié)考慮，挑選生長理想，代謝穩(wěn)定，產(chǎn)物質(zhì)量符合要求的細胞株，而不是一味追求高表達量。

此外，基于國內(nèi)藥品集采后的現(xiàn)實形勢，成本控制顯得尤為重要。有不少研究建立模型以研究抗體產(chǎn)量與生產(chǎn)成本之間動態(tài)變化過程。追求高表達細胞株的最現(xiàn)實因素莫過于后續(xù)生產(chǎn)的上游規(guī)模和成本，相對于高表達細胞株而言，低表達細胞株無疑使得上游成本占主導位置，因此提高表達量是優(yōu)化上游生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。有研究表明，當細胞株蛋白表達量從0.5g/L增至5g/L，單抗生產(chǎn)成本大幅度降低。然而對于下游而言，在同等發(fā)酵體積下，細胞株表達量的提高意味著下游填料量的增大，從而使下游成本迅速提高。

有研究表明，當細胞株表達量從2 g/L提高到10 g/L時，下游成本從總支出的48%提高到73%。另有研究指出，當表達量達到5g/L以上時，對成本影響減弱，轉(zhuǎn)化為下游過程控制主導。因此，對于當下環(huán)境而言，或許更需考慮平衡上下游成本，對于細胞株的表達量，也多了一個重要的現(xiàn)實考慮因素。

關(guān)于細胞株表達量的二三事討論到此就告一段落了，細胞株表達量這一簡單而直觀的數(shù)據(jù)背后，還蘊藏著許多值得思考和探討的話題，文中的幾個方面只是冰山一角，海面下隱藏的信息值得繼續(xù)挖掘。通過以上討論，我們能更深切地認識到，細胞株構(gòu)建的工作，與其說是在花園里尋找一朵最美麗的玫瑰花，不如說是找到一朵足夠美麗的——美麗，沒有硬傷，這就是我們想要的，適合我們的玫瑰了。

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關(guān)于皓陽生物

杭州皓陽生物技術(shù)有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體和重組蛋白藥物開發(fā)服務的國家高新技術(shù)企業(yè)。公司擁有抗體藥物人源化和成藥性分析、穩(wěn)定細胞株構(gòu)建、發(fā)酵工藝開發(fā)、純化工藝開發(fā)、制劑處方開發(fā)、分析方法開發(fā)、抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）開發(fā)、培養(yǎng)基定制開發(fā)等多個藥物開發(fā)平臺，建有完善的1000L規(guī)模原液和成品GMP生產(chǎn)線，能夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生產(chǎn)一站式純粹與專業(yè)CDMO服務。公司現(xiàn)有研發(fā)實驗室面積5000平方米，總投資近億元。自成立以來，公司為國內(nèi)外多個新藥研發(fā)企業(yè)提供生物藥物技術(shù)研發(fā)服務，同時與多家知名醫(yī)藥公司達成戰(zhàn)略合作。

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