摘 要

生物制藥CMC通常包含四個模塊：上游培養、下游純化、制劑灌裝和分析質控。下游純化是將上游得到的細胞培養液澄清后，進行純化生產從而得到原液的過程。

那么為了在固定的工藝下使產品質量達到預期，就需要確認工藝參數的操作范圍，通過工藝設計來控制對藥品安全性和有效性有顯著影響的關鍵屬性。實驗設計(DOE)是一種設計實驗并分析所獲得信息的技術。這種技術可以使我們在最小數量的實驗中建立實驗參數與結果的數學模型，找到最佳工藝條件，確定工藝的操作窗口。

本期皓奇星我們便來介紹一下DOE的實驗設計方法及其在下游層析工藝中的應用。

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什么是DOE？

實驗設計(DOE，Design Of Experiment)，是研究和處理多因子與響應變量關系的一種方法。它通過合理地挑選實驗條件，安排實驗，并通過對實驗數據的分析，從而建立響應與因子之間的函數關系，或者找出總體最優的改進方案。它可以用最少的實驗數量得到最大的信息量并可以發現各個因子之間的交互作用，探索整個實驗區間。

在工藝開發期間，利用DOE的實驗方法我們可以在眾多影響響應值Y值的因子X中確定哪些對響應有顯著影響，確定如何改變這些因子的取值使響應達到最佳值。DOE實驗通過對實驗結果的分析獲得傳遞函數，得到Y與各因子X的關系式。采用DOE的方法，因子X的范圍選擇廣，且可以進行精確的控制，這也使得DOE實驗可以探索到整體的最佳方案，使實驗結果取得突破性的改善。

02

DOE的基本術語

因子：所有可能影響實驗結果的參數。通常可被控制，但也可能不可控制即噪聲因子。該參數既可以是數值也可以為種類，比如層析過程中的pH、電導率、鹽類型、填料種類等。

響應：一個或多個可測量的變量描述的實驗結果。比如層析過程中的回收率、純度、HCP含量等。

模型/傳遞函數：在變量統計分析的基礎上建立的數學模型。可以描述工藝參數X與響應值Y的關系，并對不可測量的因子采用預測響應，可以量化隨機變化的大小。

下圖列舉了部分層析過程中涉及到的因子X和響應值Y。

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DOE的一般步驟

●?明確目的，通過歷史數據或經驗確定實驗目標。

●?確定實驗的輸出結果響應值Y；確定因子X及其水平。

●?確定每個實驗因子X的實際取值，并確定實驗計劃。

●?按照實驗計劃隨機進行實驗，并測量輸出值Y。

●?整理、分析數據，進行方差分析和回歸分析。找出主要影響因素并確定因子X和響應Y的關系式。

●?確定最優的因子組合。

●?在最優的因子組合范圍內重復實驗，進行驗證。

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DOE常見設計優缺點比較

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案例分析

在皓陽生物某融合蛋白的親和捕獲過程中，由于細胞培養液中蛋白表達量高且聚集體含量較高，很難達到親和洗脫液HPLC-SEC純度和回收率的平衡的情況。于是，采用DOE實驗設計進行洗脫條件的優化，試圖找到回收率和HPLC-SEC純度均大于90%的工藝操作窗口。

首先，確定響應值Y為回收率和HPLC-SEC純度；根據經驗確定因子X為洗脫緩沖液的pH（范圍3.0-3.8）及鹽濃度（范圍20mM-100mM）；選擇響應曲面設計中CCF模型進行2因素2水平的實驗設計，共設計了11組實驗（3組中心點）。按照模型列出的實驗條件進行親和層析，收集洗脫液并進行HPLC-SEC純度檢測和回收率的計算，將響應值Y的結果回輸并進行統計學分析。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??

DOE實驗結果表明，洗脫液pH及鹽濃度均為親和捕獲工藝中純度和回收率的顯著影響因素，在實驗條件范圍內，pH越高，收率越低，純度越高。

為了進一步驗證DOE實驗優化得到的最優洗脫條件，將層析柱直徑放大至5cm并用該洗脫條件重復實驗，實驗結果均達到預期。最終確定了親和層析洗脫緩沖液pH及鹽濃度區間范圍，獲得的目標蛋白純度>90%，回收率>90%。該工藝經過10L反應器培養液進行放大驗證后，成功應用于3批200L中試生產，工藝方法穩定可行。

隨著生物行業的不斷發展，產品種類繁多，各種復雜類型的雙抗和融合蛋白的開發必將為下游純化工藝帶來挑戰和考驗。結合實際需求，善用DOE等實驗工具，相信再荊棘叢生的路，也終究會豁然開朗，柳暗花明。