1970年，Awdeh等做了一有趣的實驗，用人腫瘤細胞5563表達一IgG抗體，他們發現原本在IEF膠上同質的抗體進行了脈沖標記實驗十分鐘立刻呈現異質性。至此研究者們意識到酶催化和非酶催化的翻譯后修飾和降解均能引起抗體異質性，例如錯配二硫鍵、糖基化、N端谷氨酰胺環化、C端賴氨酸剪切、脫酰胺、氧化、糖化、肽鍵斷裂。而后眾多實驗研究發現抗體的異質性在細胞內加工、細胞外處理、純化過程及儲存過程均能引入，抗體的異質性是不可避免的。因而也需運用多種不同原理的分析方法去分析抗體的異質性。異質性又可繼續細分為電荷異質性、疏水異質性、分子大小異質性、高級結構異質性等。其中電荷異質性監測被認為是監控翻譯后修飾最靈敏的方法。

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?電荷變異體的概念

由于表面凈電荷和電荷分布的差異，導致色譜、電泳行為產生差異，這些存在電荷異質性的蛋白常被稱為電荷變異體（藥典委翻譯，后續以此作為標準叫法）或電荷異構體（Charge Variant）。等電聚焦電泳（IEF）或毛細管等電聚焦電泳（cIEF）中，相對主峰（Main），酸性變異體（Acidic）是pI較低的一類組分，堿性變異體(Basic)則是pI更高的組分。若是采用CEX分析，酸性變異體則在主峰之前被洗脫，堿性變異體比主峰洗脫更晚，AEX和CZE分析則相反。

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電荷變異體的來源分類

2.1 主峰并非是未經修飾或未發生降解的抗體，事實上主要由以下三種典型的翻譯后修飾構成。

表1 主峰產生原因?

序號	產生原因	影響
1	N端環化成焦谷氨酸 （N-terminal PyroGlu）	無影響
2	C端賴氨酸缺失 (C-terminal Lys Clipping)	CDC
3	N糖基化中性糖鏈 (N-Glycosylation)	PK，ADCC，CDC，穩定性

2.2 酸性變異體的形成原因主要是堿性基團的缺失、酸性基團的引入、構象改變及其他與CEX柱結合能力降低的修飾等。

?表2?酸性變異體產生原因

序號	產生原因	影響
1	唾液酸 (Sialic Acid)	PK，ADCC，免疫原性
2	天冬酰胺及谷氨酰胺脫酰胺 (Deamidation)	結合活性，效價
3	二硫鍵被還原 (Reduced Disulfide Bonds)	穩定性，效價
4	游離巰基發生半胱氨酸化 (Cysteinylation)	穩定性，生物學活性
5	賴氨酸糖化 （Glycation）	聚集
6	O糖基化 （O-Glycosylation）	結合活性，穩定性，PK
7	琥珀酰亞胺（天冬酰胺） （Succinimide from Asn）	結合活性，效價
8	二硫鍵錯配 (Disulfide Bond Scramble)	生物學活性，穩定性，效價
9	三硫鍵 (Thiosulfide Modification)	無影響
10	馬來酸酰脲 （Maleuric Acid）	未知
11	檸檬酸修飾 (Citric Acid Modification)	未知
12	丙酮醛修飾 (Methylglyoxal)	未知
13	硫醚鍵 (Thioether Linkage)	未知

2.3 堿性變異體的形成原因主要是堿性基團不完全切除、額外堿性基團的引入、構象改變及其他與CEX柱結合能力增加的修飾等。

表3?堿性變異體產生原因

序號	產生原因	影響
1	C端賴氨酸不完全切除 (C-terminal Lys )	CDC
2	N端谷氨酰胺環化不完全 (N-terminal Gln )	無影響
3	脯氨酸酰胺化 (Proline Amidation)	無影響
4	絲氨酸突變成精氨酸 (Ser Mutation to Arg )	未知
5	琥珀酰亞胺（天冬氨酸） (Succinimide from Asp)	結合活性，效價
6	N糖糖基化缺失 (Aglycosylation)	PK，ADCC，CDC，穩定性
7	谷胱甘肽修飾 (Glutathionylation)	穩定性，生物學活性

2.4???還有很多修飾或者降解，其引起的電荷變化不固定。

表4? 電荷不固定的修飾或降解情況匯總表

序號	產生原因	影響
1	蛋氨酸、色氨酸、組氨酸氧化 (Met、Trp、His Oxidation)	穩定性，PK，結合活性
2	碎片 (Fragments)	生物學活性，PK，免疫原性
3	聚體 (Aggregates)	生物學活性，免疫原性，效能
4	天冬氨酸異構化 (Iso-Asp)	結合活性，效價
5	信號肽不完全切除 (Incomplete Removal of Signal Peptide)	未知
6	高甘露糖 (High Mannose)	PK，ADCC，CDC
7	氨基酸突變 (Amino Acid Mutation)	未知

其中關于高甘露糖，有研究者發現酸性變異體中富集大量高甘露糖糖型，此糖型雖為中性糖，但其可能因為改變了蛋白構象，進而影響了蛋白與離子交換柱的結合而使高甘露糖修飾的蛋白呈現酸性變異體性質；另有研究結果顯示在堿性變異體中甘露糖修飾大量富集，但有研究者單獨研究含高甘露糖糖型的Fc段與聚體或電荷變異體的形成，兩者又無顯著相關性。甘露糖型與電荷異質性的影響仍需進一步研究。

為了更清晰的呈現這些修飾或降解對電荷的影響，此處引用張伯彥先生之前培訓的一張PPT。具體的翻譯后修飾成因和影響，將在下一期詳細解讀。

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電荷變異體對抗體藥物功能影響

電荷變異體的產生會影響抗體藥物的結合能力（Binding）、生物學活性（Bioactivity）、藥代動力學（Pharmacokinetic）、免疫原性（Immunogenicity）以及結構穩定性（Stability）等，進而會影響藥物的有效性和安全性。2.1-2.4表格中已經對有文獻報道的各個修飾或降解易產生的影響進行了歸納總結，但具體情況還是需要根據修飾所在位點進行具體分析。

3.1?電荷變異體對于藥物代謝動力學的影響

⑴??有研究者利用化學修飾方式增加抗體正負電荷基團，結果顯示改變蛋白和細胞表面靶點的結合，從而影響組織穿透性、組織分布和藥代動力學。

⑵??基因泰克公司曾對上市抗體及臨床前抗體藥物關于電荷變化產生的藥代方面的影響做過一個總結，結果表明：①當電荷變異超過一個 pH 單位時，會影響藥物的組織分布及藥代動力學；②增加正電荷，會提高藥物的組織蓄積，提高血漿清除率（Blood Clearance）；③降低正電荷，會減少藥物的組織蓄積，提高藥物全身總清除率(Body Clearance)。此結論也被Zheng等其他研究者證實，pI值高的抗體呈現更高的血漿清除率，導致抗體半衰期降低；對于皮下注射的藥物也會降低其生物利用度。

⑶? 值得注意的是，這些變異體均是通過人為修飾且大量富集某一特定修飾組分得到的。多種修飾混合組成的酸堿性變異體（pI=8.7-9.1）與目的組分或原材料相比，在與FcRn結合能力、PK數值及生物學效能方面并未呈現顯著差異，只是酸性變異體與FcRn的結合能力及生物學效能略下降，但均在方法波動范圍內。而Gandhi等的研究顯示酸性變異體與FcRn結合能力與目的組分相當；堿性組分由于富集了大量聚體，增加了總親合力，與FcRn的結合能力更強。Jan Visser等也富集了末端脯氨酸酰胺化的抗體(9%)與原低含量組分進行了生物學活性（結合、ADCC和CDC）、藥代動力學（AUC 、Cmax）、毒理實驗等對比研究，未顯示有顯著差異。

⑷? 或許由于翻譯后修飾成分與比例的不同，或許是對pI的貢獻不同及pI變化程度不大，導致酸堿變異體在藥物代謝方面的影響程度不同而呈現不完全類似的結果，這些均有待近一步研究考證。

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電荷變異體定量分析方法概述

如前述所說，色譜法和電泳法是兩種最常用的電荷變異體分析方法，也是目前2015版中國藥典收錄的兩大類用于電荷異質性分析的方法，主要包括離子交換色譜（IEC）、等電聚焦電泳（IEF）、毛細管區帶電泳（CZE）、毛細管等電聚焦電泳（cIEF）。

4.1離子交換色譜

離子交換色譜可分為陰離子交換色譜（AEX）和陽離子交換色譜（CEX）。由于大部分抗體都是弱堿性，CEX最為常用的。離子交換方法耐用、分辨率高且不需要特殊專用儀器（高效液相即可），還可以放大用于分離制備電荷變異體做更深入的研究，曾被認為是分析電荷變異體的金標準方法。其優缺點總結如下表5。

4.2電泳法

電泳法包括等電聚焦電泳（IEF）、毛細管區帶電泳（CZE）、毛細管等電聚焦電泳（cIEF）。

4.2.1 平板等電聚焦電泳（IEF）因操作繁瑣、分辨率低且定量不準確，已逐步被毛細管電泳替代。

4.2.2 目前cIEF又根據成像和檢測的差異區分成傳統cIEF（需用壓力或改變檢測器末端電極槽儲備液的pH值的方法使溶質通過檢測器）和全柱成像等電聚焦毛細管電泳（icIEF，采用全柱成像方式進行檢測）。icIEF方法由于聚焦完成后不需要遷移，相比傳統cIEF有明顯的優勢。其優缺點總結在下表5。在2019年3月6日，國家藥典委員會發布了《關于單抗電荷變異體測定法（icIEF法）標準草案的公示》，擬收錄icIEF法作為測定電荷變異體藥典標準方法。

4.2.3 ?CZE的方法由于使用簡單的分離緩沖體系和非涂層毛細管，制樣過程簡單、方法通用性好，同時可得到高分辨率和高重現性的分離結果，目前也被廣泛用于鑒定及電荷異質性檢測。

4.3電荷變異體定量結果差異

4.3.1 大部分情況下，電荷變異體基于等電聚焦和色譜分離兩種方式上行為一致，但由于分離機理的差異，有時存在細微差異。IEF或cIEF分離電荷變異體基于凈電荷差異（Overall Charge Difference ，Apparent pI）；IEC除了凈電荷的作用，電荷分布、蛋白幾何結構（Distribution of Charge）在分離過程也中起重要作用；IEF和IEC在表征電荷變異體時存在的差異現象已被證明。如天冬氨酸異構化后pI不會改變，在IEC的行為由于構象差異會產生變化。而CZE是基于蛋白電荷和流體力學尺寸（Hydrodynamic Size）差異導致變異體遷移率不同，機理和呈現的結果與另外兩類方法存在差異。

4.3.2 源于方法的不同以及分離度差異，目前報道的四種方法對于同一蛋白的定量結果是有差異的（如圖4），同時因蛋白不同，酸堿變異體組成和比例也不同，因而不需要像關注聚集體那樣限定絕對值，而是監測相關CQA峰的比例差異即可。四種方法中何種方法分辨率最高，也因實際情況而定。

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電荷變異體表征方法概述

5.1酶解對比

應用對應酶進行酶解，對比酶解前后的變化對峰進行定性。如CPB酶切可確定K變異體；唾液酸酶酶切可確定唾液酸峰；Endo-S或PNGase-F酶切可確定N糖引起的變異體等。該方法簡單快速，但只可鑒定特定的修飾。

5.2IEC-MS 或CE-MS直接表征

利用揮發性鹽開發IEC方法，調整液相聯用系統相關部件，可對分離的電荷變異體直接進行質譜分析；另一方面，近幾年不斷發展的毛細管電泳與質譜聯用技術已實現抗體經cIEF或CZE分離后直接進行質譜檢測[i]。此兩種方法均可實現電荷變異體分離后實時完整分子量鑒定，表征不同電荷變異體的分子量差異，如相差128Da則可判定為賴氨酸變異體；也可用于快速監測抗體穩定性試驗中產生翻譯后修飾變化。另一方面，結合各類酶酶解試驗，去除特定的翻譯后修飾干擾，亦可進一步表征其他電荷變異體翻譯后修飾情況。當然該方法仍有局限性，一是該方法只能從完整分子量或亞基層面進行測定，分子量較大，對于分子量差別小的翻譯后修飾情況，定性誤差較大；二是和先分離收集組分再分析相比，無法同時提供活性檢測樣品；三是蛋白的高糖基化修飾會影響質譜響應值，且糖基化修飾比例復雜，會增加定性分析難度。

5.3分離收集后表征

應用適當的方法分離并富集電荷純度較高的電荷變異體，進而利用多種分析手段全面檢測電荷變異體的差別，比如翻譯后修飾、生物學活性、高級結構、藥代動力學等。目前文獻報道的分離收集方法主要有以下三種。

5.3.1??IEC-HPLC分離收集：通過分段收集或柱體積等比放大后分段收集，再進行濃縮換液得到電荷純度較高的電荷變異體。該方法可利用已確定的IEC-HPLC方法直接進行分離，但分離量低，收集精度差，難以實現對每個變異體峰進行分離富集，富集過程耗時耗力。

5.3.2 ?置換色譜（Displacement Chromatography）分離收集：抗體與離子交換色譜柱結合后，用另一種與固定相作用力極強的置換劑（Displacer）通入色譜柱，去替代結合在固定相表面的溶質分子。最終抗體中的電荷變異體按作用力強弱的次序，形成一系列前后相鄰的譜帶，流出色譜柱，得以分離電荷變異體。Zhang等采用Sachem Expell SP1置換劑，并通過陽離子交換色譜成功分離IgG1電荷異構體，各組分回收率>70%，電荷純度>90%。該方法上樣量大、產率高、分辨率好，正逐步被應用于生物分子的制備性分離與純化。但置換劑、固定相、流動相的選擇均是關鍵參數，各參數均需要進行大量優化工作。?

圖 6? 置換色譜分離圖譜

5.3.3?自由流電泳（Free Flow Electrophoresis，FFE）分離收集：與上述兩種基于色譜分離原理的收集方式相比，自由流電泳是一種基于等電聚焦電泳原理的電荷變異體分離制備工具。自由流電泳的分離單元（可以對應色譜法中的色譜柱）本質為一個腔體。當緩沖液（兩性電解質）從一端往另一端流動的同時，在流動方向的兩側加上電壓，在流動方向的垂直方向形成pH梯度。待分離物質以恒定濃度和流速隨著緩沖液流入端注入分離單元，一方面在電壓和pH梯度的作用下等電聚焦，另一方面被緩沖液帶動向出口端流動，最終出口端通過96通道流入96孔板。接下來只需要檢測96孔板，回收對應孔中的組分，最終實現不同電荷變異體的分離和富集。自由流電泳可達到icIEF高分辨率，完成單個變異體峰分離，同時單次實驗分離量可以達到100mg蛋白。但該方法需有特定的儀器，分離過程需加尿素等促溶劑和兩性電解質，最終的樣品也需要進行濃縮換液等步驟，蛋白穩定性可能會受影響。

隨著質量源于設計（QbD）理念逐步在生物制藥產業的深入，電荷變異體將是生物藥物研發、生產中質量控制必須考慮的因素。對電荷變異體進行有效分離、鑒定，確認變異體對于藥物功能方面的影響，進而對納入關鍵質量屬性（CQA）的變異體進行監控，將有助于實現藥物的安全、有效、質量可控。

引用文獻：

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2.? 張鑫濤，rCHO細胞培養表達的單克隆抗體電荷異質性研究[D]華東理工大學，2017年

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