如果將下游工藝開發看成是爬山，那么陽離子層析可以算是最難跨過的山峰之一。陽離子工藝開發過程可能會遇到單抗洗脫有兩個洗脫峰的情況，小編在某項目中就遇到了這一現象，進而對雙峰出現的原因和解決方法進行了文獻查閱和實驗探索。

01 陽離子層析洗脫雙峰現象

Jing Guo[1], Haibin Luo[2]?等在研究中發現，某些抗體陽離子層析工藝開發時出現洗脫峰雙峰現象（圖1A）[2]；將A中的兩個峰分別收集、透析后重復陽離子層析過程，發現兩者洗脫圖譜峰形相同（圖1 B）[2]，且依然呈現雙洗脫峰現象，即雙峰組分無明顯差異；研究者進而發現，在不同上樣載量條件下，洗脫圖譜均為相似的雙峰（圖1 C）[2]。這與小編在項目推進中遇到的情況非常相似。

02 陽離子層析出現雙峰原因

Haibin Luo[2]?等進一步探究了抗體陽離子層析出現雙洗脫峰的原因：組氨酸存在于絕大多數抗體蛋白中，而組氨酸基團在不同pH緩沖液條件下帶電情況也會不同。一個組氨酸殘基的平均pKa是6.0，但組氨酸殘基在疏水環境中通常具有更低pKa和較慢的質子化速率。焦碳酸二乙酯(DEPC)可特異性結合溶劑和蛋白質表面未質子化的組氨酸殘基，而羥胺可以去除DEPC對組氨酸的修飾（圖2A）[2]；DEPC對組氨酸的修飾過程及羥胺的去組氨酸DEPC修飾過程均不會對抗體結構產生影響，可通過質譜確定被DEPC修飾的組氨酸位點，且DEPC修飾不會對蛋白紫外吸收造成影響（圖2D）[2]，即可通過組氨酸DEPC修飾/去修飾來研究組氨酸對抗體陽離子層析出現雙洗脫峰的影響。如圖2B、2C所示，選擇不同時間/程度的組氨酸DEPC修飾及去DEPC修飾的抗體產物進行陽離子層析，可見隨著組氨酸DEPC修飾時間/程度的增加，洗脫雙峰現象有所變化直至消失（圖C3基本呈現單洗脫峰）[2]；而隨著羥胺的去組氨酸DEPC修飾時間/程度的增加，雙峰現象重新出現。上述實驗證明抗體序列中的組氨酸是導致抗體陽離子層析雙洗脫峰的因素。

如圖3A[2]顯示，經質譜鑒定，1號組氨酸殘基位于可變結構域，2-10號組氨酸殘基位于恒定結構域（大多數單抗都有，但陽離子層析多數未表現出雙峰現象）。使用F(ab’)2蛋白酶切除Fc Region后，對酶切產物F(ab’)2 進行陽離子層析純化時，同樣出現了雙峰現象（圖3B）。該結果表明F(ab’)2的組氨酸很有可能是導致陽離子層析雙洗脫峰的因素，但是并不能確定是可變結構域的1號組氨酸還是恒定結構域的2-5號組氨酸的影響。

03 陽離子層析雙峰解決策略

3.1.陽離子填料篩選

Haibin Luo[2]等發現，在相同層析洗脫條件（50mM NaAc，NaCl梯度洗脫）下，使用不同的層析填料會有不同的色譜表現：如POROS 50HS和Fractogel SO3-(M)陽離子洗脫出現兩個峰，Nuvia S和Source 30S出現肩峰，而Toyopearl SP 650M為單洗脫峰（圖4），即可通過填料篩選避免工藝中雙峰的產生。

但是詳細對比這幾種填料的具體信息表1，小編發現陽離子洗脫雙峰現象和填料的基質或配基沒有必然的聯系，應該是一種綜合的影響：如Fractogel SO3-(M)和Toyoperal SP 650M的填料基質都是聚甲基丙烯酸酯，而一個洗脫有雙峰另一個沒有。Source 30S和Sepharose SP配基相同一個洗脫峰雙峰另一個是肩峰。

3.2洗脫Buffer的選擇

如上所述，小編在某抗體項目陽離子工藝開發也遇到了雙峰現象，將兩個峰分別收集檢測后發現蛋白質量沒有顯著差異。因為種種原因，本項目無法更換不同基質或配基的填料，且通過改變上樣及洗脫pH（圖5a）、增加低鹽淋洗（圖5b）等均無法完全避免雙峰的情況。通過進一步查閱文獻，小編發現精氨酸可以改變蛋白和填料作用力，于是嘗試了一下發現洗脫液中添加一定濃度的精氨酸，確實可以避免陽離子層析雙洗脫峰的產生（圖5c、5d）；該工藝經中試250L培養體積的下游純化生產驗證，證明工藝穩定性及可放大性良好。

關于精氨酸和抗體相互作用從而影響抗體洗脫的原理也有很多研究和報道［3］。精氨酸含有胍基團和一個兩性分子，有研究者對比研究了胍和精氨酸對蛋白層析表現的影響。圖6 a顯示的是胍對研究蛋白在Capto MMC層析洗脫的鹽濃度的影響：根據圖a中黑色和灰色高度對比，可見加入0.035M 胍濃度對層析洗脫鹽濃度有較大影響，部分蛋白洗脫鹽濃度增加，部分蛋白洗脫鹽濃度降低；b顯示的精氨酸對研究蛋白在Capto MMC層析洗脫鹽濃度影響：可見在加入0.035M 精氨酸后多數蛋白洗脫鹽濃度顯著降低，即精氨酸對洗脫鹽濃度有顯著影響，可以降低蛋白洗脫的鹽濃度。a和b的對比說明精氨酸中的胍基對蛋白的色譜表現有一定影響，但精氨酸整體分子對蛋白洗脫的的影響作用更加具有規律性，Capto MMC層析中能夠降低蛋白的洗脫鹽濃度。

Siddharth Parimal,等利用分子動力學（Molecular Dynamics,MD）模擬研究胍和精氨酸與蛋白質的相互作用，圖7［3］結果顯示胍和精氨酸會與蛋白表面帶正負電的基團同時存在相互作用，進而影響蛋白的表面電荷分布。

Siddharth Parimal還通過電荷間相互作用來分析胍和精氨酸對蛋白和填料結合的影響。精氨酸和胍都含有帶正電荷的基團。胍和精氨酸分子的胍基與Capto MMC配體有靜電相互作用。圖8 a顯示沒有精氨酸和胍添加的蛋白和填料相互作用，蛋白只有帶正電基團能與填料相結合；圖8 b顯示胍對蛋白和填料相互作用，胍帶正電可以分別結合填料和蛋白的負電基團，改變填料和蛋白之間的結合位點，從而影響蛋白和填料的相互作用力。對不同性質的蛋白起到增大或減少與填料結合力的效果；圖8 c顯示精氨酸也可以同時結合蛋白或者填料。由于精氨酸分子比胍分子大很多，精氨酸與蛋白結合后由于空間位阻會導致蛋白無法和填料相結合，降低了蛋白和填料之間的結合力，使蛋白可以更低的鹽濃度洗脫。

Siddharth Parimal用分子動力學和電荷相互作用分析精氨酸和胍會和蛋白的表面帶電基團相互作用，結果表明在層析時加入精氨酸和胍會改變蛋白和填料之間的結合作用力。精氨酸由于分子較大同時帶有正負電基團對蛋白結合影響更顯著，可降低陽離子層析蛋白洗脫的鹽濃度。

04 總結

抗體陽離子層析出現雙洗脫峰，可能與抗體序列中組氨酸有關系。可以嘗試通過篩選不同的填料來解決；也可嘗試在洗脫液中加入精氨酸或直接精氨酸洗脫，通過改變蛋白和填料的結合力，來避免雙洗脫峰的產生。

參考文獻

[1]Jing G , Creasy A D , Barker G , et al. Surface induced three-peak elution behavior of a monoclonal antibody during cation exchange chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2016, 1474:85-94

[2]Luo H , ?Cao M , ?Newell K , et al. Double-peak elution profile of a monoclonal antibody in cation exchange chromatography is caused by histidine-protonation-based charge variants[J]. Journal of Chromatography A, 2015.

[3]?Parimal S , ?Garde S , ?Cramer S M .?Effect of guanidine and arginine on protein-ligand interactions in multimodal cation-exchange chromatography.[J]. Biotechnology Progress, 2016.

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