在蛋白質藥物開發和商業化生產、使用過程中，蛋白的聚集被認為是一個主要的挑戰。在整個的蛋白藥物開發和生產過程中均可能發生蛋白質聚集，如細胞培養、蛋白純化、成品灌裝和存儲；此外在病人使用時也可能會出現蛋白質聚集。蛋白質聚集可能對產品質量和活性有顯著的負面影響。盡管一些蛋白質的聚集物可以通過可逆解離維持其體內活性，但通常蛋白質聚體會降低或沒有生物活性，并且會產生免疫原性，最終導致藥物無效。

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聚體產生路徑

聚體(Aggregate)通常由抗體分子間通過共價鍵或氫鍵等分子間作用力形成的聚合物，是由兩個或多個蛋白組成的復合物，其形成過程十分復雜。蛋白聚體可以通過不同角度分成不同類型。

1）化學鍵類型：非共價聚體（化學鍵為弱力，如氫鍵）和共價聚體（主要是通過二硫鍵相互結合的聚體）；

2）是否可逆：可逆聚體和不可逆聚體；

3）聚體大小：小的可溶性聚體（低聚物），如二聚體、三聚體、四聚體，聚體直徑一般為幾十納米到幾百納米；亞可見的不溶性微粒，聚體直徑一般為幾百納米到50μm；可見異物，聚體直徑一般50μm以上。

1.1?低聚物形成

蛋白質是帶電的兩親性物質，許多蛋白質已經被證明可以形成可逆的低聚體。蛋白質相互作用的多樣性使得蛋白質聚集形成機制復雜化，蛋白質自然形成低聚物主要的作用力有靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵、范德華力；蛋白質聚集的主要驅動力取決于蛋白質結構、溶液組成和所處的環境。

1.2 聚體的增長

最初的低聚物都可以通過多種機制生長成更大的聚合體，總體生長通常在時間上呈非線性。蛋白質聚合生長的相對速率主要取決于蛋白膠體穩定性、構象穩定性和蛋白之間相互作用。隨著蛋白質聚集體體積的增大，它們最終可能變成不溶的、形態不同的微粒，下圖展示了聚體形成的過程。

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影響聚體形成的因素

2.1 蛋白質結構

蛋白質的一級序列和疏水氨基酸的相對數量及排列會對聚體含量有很大的影響。疏水性氨基酸容易形成易聚集區域。然而蛋白質的聚集趨勢不僅受易于聚集的肽序列控制，還受序列寡肽的兩親性（amphiphilic）比例影響。在特定位置引入一個或多個不同疏水氨基酸可以顯著增加蛋白質的聚集形成速率。

蛋白質糖基化對許多蛋白質的穩定性非常重要。抗體中CH2結構域的糖基化可以穩定CH2結構域和整個抗體分子。抗體的去糖基化可能會擾亂CH2結構域的三級結構，并使Fab和Fc區域不穩定，從而加速熱誘導的聚集。甚至蛋白質中糖型結構也可以通過影響構象穩定性來改變蛋白質的聚集傾向。

蛋白質的二級結構可能在控制其聚集傾向方面發揮作用，在有游離二硫鍵蛋白質中，二級結構可以影響二硫鍵交換的速率，從而影響聚集產生的速率。

2.2 化學降解

在整個蛋白藥物的開發、生產和保存過程中蛋白質會經歷多種化學降解途徑。雖然許多降解途徑不會引起可檢測的三級結構變化，如氧化、脫酰胺，但化學降解可能會改變蛋白質構象和/或膠體穩定性，從而改變蛋白質的聚集趨勢。

蛋白質氧化后的聚集增強至少可歸因于以下影響：（1）表面疏水性增強（2）促進聚集-聚集相互作用（3）降低蛋白質的構象穩定性。

脫酰胺后蛋白質聚集的增強可能是由于蛋白質的去穩定性作用和/或蛋白-蛋白相互作用的增強。另一方面，通過脫酰胺作用引入的負電荷可能會潛在地改變整體蛋白質-蛋白質靜電相互作用，導致蛋白質聚集增加。

近幾年，在生物藥中抗體偶連藥物（ADC）也越來越多。與抗體相比，ADC的穩定性一般比抗體本身更差。這是因為偶連的（疏水性）藥物分子會提高的抗體表面疏水性，小分子藥物與抗體比(DAR)的增加會逐步增加聚集傾向。

2.3 溫度

溫度通過影響蛋白質溶液的多種特性來影響蛋白質聚集，包括蛋白質擴散速度、蛋白質-蛋白質相互作用、構象穩定性和化學降解。溫度的升高使化學反應加速，如氧化和脫酰胺反應水平就會更高。溫度升高會加速蛋白分子之間的相互碰撞速度，從而也更容易產生聚體。當溫度高到一定程度，蛋白高級結構就會打開，從而使疏水基團暴露，進而產生聚體。

2.4 溶液

蛋白穩定性（構象穩定性和膠體穩定性）與蛋白所處的溶液有很強的相關性，其中最重要的條件為溶液的pH，它可以同時影響構象穩定性和膠體穩定性，此外還會影響蛋白質化學降解速度和方向，最典型的就是脫酰胺反應；改變溶液的pH可以改變蛋白的天然結構和蛋白與蛋白之間的相互作用。

另一個影響蛋白質聚集的重要溶液條件是離子強度。離子強度可能通過影響構象穩定性和蛋白質-蛋白質相互作用的性質和程度來影響蛋白質聚集程度。此外，離子強度的影響程度通常取決于溶液的pH值。陽離子和陰離子鹽都可以與蛋白質分子相互作用，以特異性結合或非特異性屏蔽調節蛋白質聚集，它們的相對影響可能不遵循hoffmeister series。

此外，在制劑中添加其他輔料可以減少聚體的形成，如精氨酸、蔗糖、海藻糖、山梨醇等多元醇類物質以及表面活性劑；但是一些公認的蛋白質穩定劑在某些條件下實際上可以促進蛋白質聚集。研究發現，在攪拌條件下蔗糖或海藻糖等糖可促進多種蛋白質的聚集。有人提出，高濃度的海藻糖(> 500 mM)可能在蛋白質表面形成簇并競爭水分子，促進蛋白質-蛋白質相互作用。表面活性劑，如聚山梨酯，被證明可以減少蛋白質在振搖和凍融過程中聚集或顆粒形成。但聚山梨酯中的一些雜質會增加聚體的產生，如不溶性脂肪酸，過氧化物，聚氧乙烯脂肪酸酯（POE），脂肪酸脂，醛。

2.5 蛋白濃度

蛋白分子在溶液中做不規則的布朗運動，隨著蛋白濃度的增加，蛋白分子之間的相互作用也會增強，相互碰撞幾率也會增加，這會導致聚體增加。

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聚體分析方法

生物制藥工業中可用于檢測、表征、定量和監測生物制藥蛋白產品中聚體的分析方法數量在不斷的增加。下圖列出了用于檢測聚體的最常用方法，每種方法都有自身的局限性，需要結合聚體的特性選擇合適的方法進行檢測。

分子排阻液相色譜法（SEC-HPLC）是對二聚體、多聚體、碎片等蛋白質雜質使用最廣泛的分析方法。該方法具有較高的靈敏度、精密度、分離度、準確性，并且可以進行高通量測試。但是作為色譜方法，在檢測過程也可能導致聚集，如在樣品制備過程中，濃度較高時需要稀釋，如果稀釋液不合適，稀釋過程會產生聚體。同時SEC-HPLC對碎片的分離能力較差，得到的碎片結果有一定誤差。同時還要考慮蛋白在流動相和色譜柱的穩定性，它的結果是否代表藥品中真實存在的聚集體；另外由于每種方法的局限性，可能需要其他方法進行交叉驗證。

SEC-HPLC結果常常用分析型超速離心（AUC））進行確認。分析型超速離心技術的分析方法主要有沉降速率（Sedimentation Velocity）和沉降平衡（Sedimentation Equilibrium）兩種。沉降速率是一項流體動力學技術。沉降速率實驗中，樣品被高速旋轉，溶質分子向樣品池底部移動，通過記錄的數據來測定溶質分子運動的速率。運動速率用沉降系數表示，它取決于分子量、分子形狀或構象。對于不同組分的樣品，根據不同的沉降系數檢測每個組分。沉降平衡是一項熱力學技術。沉降平衡試驗在較低的轉速下進行，當沉降作用與擴散作用達到平衡時測定分子平衡濃度的分布。在平衡狀態下，濃度的分布只決定于質量而與分子的形狀無關。離心開始時，分子顆粒發生沉降，一段時間以后，沉降的結果造成了濃度梯度，因而產生了蛋白質分子反向擴散運動，當反向擴散與離心沉降達到平衡時，濃度分布固定不變。掃描得到沉降數據后，通過后續軟件分析可得到樣品表征結果，目前普遍應用SEDFIT/SEDPHAT分析軟件，根據分析結果可精準檢測生物大分子聚集狀態以及聚集體準確百分比含量。但AUC也有自身的缺陷，該設備價格昂貴，設備的使用維護需要專業技術，另外每次檢測樣品耗時較長，不合適大批量檢測。

在用于聚體表征的方法中，場流分離是另一種分離技術，該技術垂直于樣品流施加一個力場，使不同大小和分子量的蛋白質分離成為可能。近年來，非對稱流場流分餾技術(AF4)被應用于分離。AF4在通道邊界處有一個可滲透板塊。當樣品在通道中流動時，由于層流流動，流體在邊界處的速度比在中心處的速度慢，所以形成了拋物線速度剖面。當施加垂直力場時，樣品中的分析物被推向邊界。布朗運動產生一種抵消運動，使較小的粒子趨向于離邊界更遠的平衡位置。這種類型的分離范圍廣，適用于各種洗脫液。

動態光散射（DLS）是利用粒子在溶液中做布朗運動，粒子布朗運動的速度依賴于粒子的大小和媒體粘度，粒子越小，媒體粘度越小，布朗運動越快。這種運動使散射光產生多普勒頻移。動態光散射技術(Dynamic Light Scattering，DLS)通過測量樣品散射光強度起伏的變化來得出樣品顆粒大小的信息。

亞可見不溶性微粒的檢測常用光阻法（Light Obscuration）、顯微計數法（Light Microscopy）和微流成像技術（Micro Flow imaging）。光阻法（Light Obscuration）和顯微計數法已經收錄于中國藥典和USP<788>章。光阻法通過光電轉換的原理自動計數樣品中不同粒徑的不溶性微粒數量，然而該方法得到的信息有限，它并不能分辨出所測微粒的性質，也無法在研發階段對其成因進行分析與控制。顯微鏡法也存在效率較低，容易因人眼疲勞導致計數誤差等弊端。微流成像技術（Micro Flow imaging）是最近這十幾年發展起來的技術，它將數碼顯微鏡，微流技術和圖像處理整合在一起。該技術利用傳感器將通過流通池的樣品信息生成圖像信息，圖像中的每個微粒都會創建一個包含計數、大小、透明度、形態等特征信息的數據庫。利用微粒的特性可以進行微粒的分類，如玻璃碎屑、硅油、氣泡、蛋白質顆粒、膠塞和纖維等，對不溶性微粒的來源或形成機制有提示作用。

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聚體的調控

4.1 蛋白質結構

一級序列及其高階結構可能決定蛋白質的聚集傾向，在進行蛋白分子設計和成藥性分析階段得到一個好的分子是降低聚體最有效的方法。去除或修飾一個聚集“熱點”可以緩解蛋白質的聚集。在某些情況下，這可以通過分析蛋白質序列或疏水性區域來實現。蛋白質表面電荷的修飾也可以改善蛋白質的溶解性和聚集傾向。經常能見到通過單個突變就可以有效地減少蛋白質聚集。然而，關鍵區域的關鍵氨基酸的去除或修飾可能會影響蛋白質活性。如果無法得到理想的分子時，就需要通過工藝開發來優化。

4.2 細胞培養

在細胞培養過程中可以通過調節培養液的理化環境來控制抗體的聚體水平，如溫度，pH以及滲透壓等。王杰等人發現在培養基中添加半胱氨酸能顯著抑制多聚體的形成，培養基中半胱氨酸添加濃度增至30mM，多聚體含量下降40%。而銅離子的添加濃度從50mM降至0mM，多聚體含量則降低了43%。培養溫度從35℃降低至32℃，重鏈結合蛋白（Bip）和蛋白二硫鍵異構酶（PDI）的表達水平均提高了89%，細胞翻譯后修飾能力顯著加強，分泌至上清液中的抗體多聚體含量相應下降了38%。聚體水平還會隨著培養液pH和滲透壓的升高而降低，增加培養液中氯化鈉的含量可以提高滲透壓，進而降低聚體水平；研究發現，培養周期越短，聚體的含量就越低，因此，當產量達標時，上游可通過減少培養時間來降低聚體含量。

4.3 蛋白純化

如果細胞培養過程中不能降低高聚體含量，則可通過純化工藝的優化來降低聚體的含量：純化中緩沖液的類型是影響聚體含量的重要因素，在純化中，Protein A洗脫抗體時使用的酸性緩沖液會導致聚體的形成。研究發現，與檸檬酸鹽、甘氨酸及組氨酸相比，此步驟的緩沖液中精氨酸的加入可降低收獲液中聚體的含量。此外還可利用陽離子層析或疏水層析、復合層析等方式將聚體去除。研發階段如果蛋白聚體含量較高，也可以利用分子排阻色譜柱進行去除，但該方法會損失較多收率，且放大有較大難度，在抗體生產中較少使用。

4.4 制劑處方

在得到純度較高的蛋白后，保存在何種溶液中會直接影響產品后續的聚體含量。主要方法包括調整溶液pH值或離子強度，以及使用穩定劑。正如前文所述，pH和離子強度對蛋白質多項特性影響，從而對聚體含量造成影響。在開發合適的制劑處方時，得到合適的pH和緩沖液種類是制劑處方開發最重要的一步。

此外，使用蛋白質穩定劑是減少蛋白質聚集的常用策略。穩定劑通過增強構象穩定性、膠體穩定性或溶解度，可以顯著緩解蛋白質聚集。糖是另一類常用的蛋白質穩定劑，可在各種條件下對抗蛋白質聚集。值得注意的是，精氨酸作為一種有效的輔料，可以很大限度地減少蛋白質聚集。精氨酸穩定蛋白質主要作用機制可能是由于它可通過靜電、疏水殘基(如Trp)相互作用被優先排除在蛋白質-蛋白質相遇復合物中，從而起到減緩蛋白質-蛋白質的關聯反應作用，最終達到減少聚體的效果。

此外，非離子表面活性劑是一類常用于制劑中的輔料，常常用于抑制振搖和凍融對蛋白質穩定性的破壞。表面活性劑通過降低蛋白質的自締合、吸附到疏水區域和/或與蛋白質弱相互作用的其他聚集傾向來減少蛋白質的聚集。在空氣-水界面，它們的疏水性勝過蛋白質分子，可以阻止蛋白質從疏水界面展開。表面活性劑還能阻止蛋白質分子吸附到其他疏水分子上，以及生產過程中存在的表面。蛋白質配方中聚山梨酯20和聚山梨酯80是最常用的兩種非離子表面活性劑。

在蛋白質生產過程或存儲過程中（預灌封注射器中），不可避免的有微量金屬離子進入溶液中，金屬離子會催化蛋白質中某些氨基酸殘基?(如Met、 Cys、His、Trp)。在生產過程中蛋白質可能會無意中暴露在微量消毒劑中，如過氧化氫；在保存過程中會遇到產生自由基的條件，如光照、跌落等。如果蛋白對金屬離子和氧化劑比較敏感，可以添加少量螯合劑和抗氧化劑，制劑中常用的螯合劑和抗氧化劑為EDTA和蛋氨酸。

4.5 冷凍干燥

如果通過制劑篩選得到配方無法將蛋白質聚集或降解控制到令人滿意的水平，通常會選擇冷凍凍干方法。但由于凍干過程可能會導致蛋白質聚集，同時凍干也是一個耗時耗能較大的工藝過程，因此需要開發一個最佳的凍干工藝，以減少凍干誘導的聚集及減少時間和能耗。例如，選擇合適降溫速率、一次干燥溫度和壓力。此外，有報道退火工藝可以通過降低表面分數和系統的全局流動性，以降低存儲期間的聚集率。制劑配方凍干產品穩定性同樣重要，因為有些蛋白質穩定劑可能并不適用于凍干蛋白，如磷酸鹽在冷凍過程中pH會改變，醋酸緩沖液在凍干過程中有可能會揮發，鹽類保護劑會降低塌陷溫度。因此需要同時評估配方信息和凍干過程，以最大限度地減少蛋白質聚集。

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