CHO細胞作為治療性抗體表達的最主要宿主細胞系，目前70%以上的治療性抗體都是由CHO細胞生產的。同樣的以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術是當下對細胞基因組進行靶向改造的最簡單最有效的方法。因此，通過基因編輯技術對CHO細胞進行工程改造應運而生。

01基因編輯簡介

上世紀50年代沃森和克里克提出DNA雙螺旋結構模型以來，分子生物學的快速發展，讓我們對基因的了解從宏觀推進到了分子層面。而以上世紀90年代鋅指核酸酶（ZFN,Zinc finger nuclease)基因編輯技術的發明為起點，直到本世紀初TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）以及CRISPR/Cas9等基因編輯技術的相繼發明，則讓我們人類得以竊取了一絲上帝造物的權柄。

目前的基因編輯技術分為兩類：CRISPR/Cas9，以及其它。CRISPR/Cas9技術自誕生以來，以其無與倫比的簡單，高效，快捷等特點，成為了當前最“炙手可熱”的基因編輯工具。2020年的諾貝爾化學獎和NCBI上多達15000篇的相關論文已經說明了一切。鑒于該技術詳盡的介紹在搜索引擎上隨處可見，我無意在此多費筆墨，請讀者們自行查閱。

典型的基因編輯工具都由兩個功能域組成：一個由氨基酸（ZFN,TALEN）或RNA（CRISPR/Cas9）介導的可編碼的序列特異性DNA結合模塊，負責對靶序列的識別；一個具有DNA內切酶活性的可切割DNA雙鏈的模塊，導致DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks, DSBs)。DSBs出現后，細胞自身的DNA修復機制啟動，對斷裂的雙鏈進行同源（Homology directed repair, HDR)或非同源末端修復（Non-homologous end joining, NHEJ)。非同源末端修復極易出錯，會帶來堿基的缺失或插入，導致移碼突變或者終止密碼子出現，由此對基因功能造成破壞，達到基因敲除的目的。而轉入帶有DNA雙鏈斷裂兩端同源臂的修復模板（Repair template），則可通過同源末端修復達到外源基因的定點插入。

02抗體的ADCC效應與巖藻糖修飾

抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ）是指抗體的Fab段結合病毒感染的細胞或腫瘤細胞的抗原表位，其Fc段與殺傷細胞（NK細胞、巨噬細胞等）表面的Fc受體結合，介導殺傷細胞直接殺傷靶細胞?？贵w通常通過鉸鏈區及CH2區域和Fcγ受體結合。CH2結構域的Asn-N297糖基化位點的糖型成分（如乙酰葡糖胺，甘露糖，巖藻糖和唾液酸等）決定CH2結構的穩定性及結合特性。有研究顯示降低Asn 297的巖藻糖修飾比例可顯著增加抗體對殺傷細胞上CD16（Fcγ受體IIIa）的親和力，并最終增加ADCC效應。

通過在CHO細胞培養基中添加抗體巖藻糖基化通路上相關酶的抑制劑或者巖藻糖類似物（如2FF）能降低抗體的巖藻糖基化水平，但是對于不同的抗體分子，往往需要通過優化添加劑的添加時間以及添加濃度才能達到理想的巖藻糖基化水平，并且在細胞工藝放大過程中的穩定性也有待考察。此外這些添加劑往往價格高昂，會顯著提升生產成本。

03基因編輯技術敲除CHO細胞fut8基因

如何才能快速穩定的生產低巖藻糖基化的抗體？我們通過查閱文獻注意到抗體的巖藻糖基化是糖蛋白翻譯后修飾的一個普遍過程，核心巖藻糖基化即向N-糖鏈的核心五糖結構(GlcNAc2Man3)還原端第一個N-乙酰葡糖胺上添加一個α-1,6連接的巖藻糖，而巖藻糖基轉移酶Fut8，是唯一一個能催化形成α-1,6巖藻糖苷鍵的巖藻糖基轉移酶。因此，如果能敲除CHO細胞基因組內表達該酶的基因，CHO細胞即可生產理論上無巖藻糖修飾的抗體。

據此，我們采用基因編輯技術，敲除了CHO-K1細胞基因組內的兩個fut8等位基因。利用敲除fut8基因后的細胞進行瞬時轉染表達，并評估抗體的表達量和巖藻糖基化水平。

從上述數據我們可以看出，野生型的CHO-K1細胞系通過平臺工藝表達的抗體，巖藻糖基化水平在75%以上；通過2FF工藝，巖藻糖基化水平在15%以下；而fut8基因敲除的細胞系Fut8-KO-CHO-K1采用平臺工藝表達的抗體其巖藻糖基化水平穩定保持在1.5%以下。從多個不同項目分子，我們可以發現無論是采用2FF工藝，還是用Fut8-KO-CHO-K1細胞，其表達量都明顯低于采用平臺工藝的CHO-K1細胞的表達量，推測是由于巖藻糖比例降低，影響了細胞內與抗體轉錄、翻譯或者分泌相關的蛋白的活性，從而導致整體表達量降低。從mAb2，mAb3項目我們可以看到，Fut8-KO-CHO-K1細胞的表達水平不低于采用2FF工藝的野生型CHO-K1細胞的表達水平，這可以證明fut8基因的缺失，并未從其它方面影響CHO細胞的生理活動。

04結語

當前，工業界仍習慣于通過隨機整合的方式來構建穩轉細胞株，通過培養工藝優化的方式來提高抗體的表達量和質量，然而，隨著基因編輯技術的不斷完善和發展，其操作越來越簡單、高效。通過外源基因定點插入轉錄熱點區域來構建穩轉細胞株，或者通過基因編輯技術來敲入或敲除抗體轉錄、翻譯、翻譯后修飾、分泌等相關的基因來調節抗體的表達量和質量，這些方法的開發和研究正在如火如荼的進行，想必不久的將來會在工業界得到良好的應用。本文通過基因編輯技術構建了一個能表達低巖藻糖修飾水平蛋白的CHO細胞系，就提供了一個很好的例子。

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